Diabolik est un criminel professionnel capable de se substituer à n'importe quelle personne grâce aux masques parfaits qu'il réalise lui-même ainsi qu'à d'incroyables gadgets. Habillé d'une combinaison noire quand il n'est pas déguisé, il utilise depuis toujours une Jaguar noire (modèle E-Type de 1961) équipée de nombreuses modifications destinées à déjouer ses poursuivants. Il est accompagné dans ses aventures par sa maîtresse, Eva Kant et pourchassé par son policier attitré, l'inspecteur Ginko. D'autres personnages réapparaissent parfois d'un épisode à l'autre, comme Altea, duchesse de Valenberg, éternelle fiancée de Ginko, ou Gustavo, ami de ce dernier. Le théâtre de ces épisodes est situé dans un pays imaginaire nommé « Clerville », à la capitale portuaire du même nom, Ghenf étant la deuxième ville plus importante de ce pays. De rares épisodes se déroulent dans le royaume du Beglait.

Ainsi que les sœurs Giussani l'ont dit et/ou écrit : Diabolik est un criminel, ce n'est pas un justicier et son code moral est très ambigu. Féroce dans les premiers épisodes, il devient de moins en moins sanguinaire sans jamais se départir de son seul but : voler. Si ses cibles, particulièrement durant les années 70 et 80, sont fréquemment des mafieux, dealers et autres malfrats, c’est parce que leurs activités illicites génèrent de grosses sommes d’argent en liquide. Sa compagne Eva montre souvent de empathie pour les « faibles » et la cause des femmes en particulier, mais Diabolik, par pudeur ou conviction, semble généralement s’en désintéresser. Il sait se montrer généreux uniquement avec celles et ceux qui l’ont volontairement aidé ou qui n'ont pas entravé ses plans.